编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
导读
乌龙茶的味道特征是由起源和烘焙复杂地塑造的。本文采用非靶向代谢组学、定量分析和感官评价相结合的综合方法来分析乌龙茶的味道特征；以闽南（MN）、闽北（MB）、台湾（TW）等25种具有代表性的乌龙茶为材料，根据化学口味表型，将其分为SX-RG-DD、GS和TGY三类。研究共鉴定出314种非挥发性化合物，其中儿茶素、茶黄素、黄酮类和氨基酸等87种和77种化合物分别被筛选为影响区域和烘焙程度的关键味觉代谢物。苦味和涩味的减少，加上鲜味、甜味和回甘的增强，与（-）-表没食子儿茶素（EGC）、（-）-表儿茶素（EC）、（-）-表儿茶素没食子酸酯（ECG）和（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的减少以及儿茶素（C）的增加有关。这些发现为进一步研究优化茶叶质量和精制加工技术提供了见解。
亮点：
1.烘焙和地区显著影响了乌龙茶的口感；
2.在五种乌龙茶中鉴定出314种与味道相关的非挥发性物质；
3.烘焙过程反映了更高的甜味和鲜味得分；
4.儿茶素、茶黄素、黄酮类化合物和氨基酸是关键的味觉化合物；
5.儿茶素与鲜味和甜味呈负相关。
论文ID
原名：Exploration of the flavor diversity of oolong teas: A comprehensive analysis using metabolomics, quantification techniques, and sensory evaluation
译名：乌龙茶风味多样性的探索：使用代谢组学、定量技术和感官评价的综合分析
期刊：Food Research International
IF：7.0
发表时间：2024.08
通讯作者：刘源教授
通讯作者单位：上海交通大学 农业与生物学院
实验设计
实验结果
1. 五种乌龙茶的口感特征
一组专家品茶师对5种不同类型的乌龙茶进行了感官评价。从每种茶中，他们精心挑选出5种具有代表性的茶产品进行后续分析，以确保每种茶的最佳代表性。如图S1所示，来自不同地区的五种乌龙茶的风味属性表现出显著的多样性，没有两个地区表现出相同的风味特征。总体风味强度、涩味和苦味在所有五种乌龙茶中都很突出，水仙茶（SX）和肉桂茶（RG）的风味强度得分最高。强度属性表示茶汤的整体浓度和丰富度。武夷岩茶以其“岩韵”而闻名，以其明显的整体丰富性而脱颖而出。SX茶和RG茶在风味特征上最为相似，鲜味、甜味和酸味和谐融合。SX的风味强度略高于RG，而两者的咸味得分最低。这两种茶是闽北武夷岩茶的主要代表。据报道，与RG相比，SX茶的氨基酸含量更高，可能促使其鲜味增加，这一发现与随后的氨基酸测量结果一致。铁观音（TGY）主要来自福建南部，通常未经烘焙，在这项研究中表现出均衡的风味特征，在温和的苦涩中，甜味和挥之不去的回甘尤为突出。尽管高山（GS）和冻顶茶（DD）来自同一地区，但它们的风味特征差异很大，这可能是由于烘焙程度的不同。DD茶经过高度烘焙，突出了苦味和涩味，同时也展现了甜味和鲜味。相比之下，轻度烘焙的GS茶与DD相比具有更强的苦味和涩味，但回味中带有明显的甜味。总之，我们的初步发现揭示了受茶品种和烘焙技术影响的三个地区乌龙茶风味特征的异同。
图1 基于LC-MS的25种乌龙茶代谢组学分析。（A）乌龙茶样品的UPLC-MS总离子色谱图。（B）五种乌龙茶非挥发性代谢物的维恩图。（C）PCA评分图。（D）代谢物的HCA分析。
2. 不同类型乌龙茶中非挥发性成分的概况
乌龙茶的独特风味特征依赖于其丰富而复杂的非挥发性风味活性化合物，而不是单一物质的存在。虽然甜味和鲜味通常很受消费者欢迎，苦味和涩味往往不太受欢迎；但是它们在提供乌龙茶复杂的感官感知方面起着至关重要的作用。一份报告回顾了茶的风味特征与其化学成分之间的相关性。本研究采用代谢组学和多元统计分析相结合的方法，对25种乌龙茶产品的非挥发性化合物进行了分析。每种茶的代表性总离子色谱图如图1（a）所示。
在25个样本中，我们共鉴定出314种非挥发性代谢物，包括儿茶素、黄酮类、有机酸（酚类和缩合类）、茶色素及其衍生物、单宁、花青素和可溶性糖等类别（表S3）。在这些代谢物中，有131种在所有25种乌龙茶中都是常见的，TGY有9种独特的代谢物，RG有2种，DD有1种，而SX和GS没有表现出任何独特检测到的代谢物（图1b）。RG的代谢物多样性最高，为277种；其次是SX，为271种；DD为160种。GS产生了237种已鉴定的代谢物，而TGY的代谢物最少，为160种（图1b）。烘焙茶的综合风味特征与更多样化的代谢物有关。结果表明，随着烘焙强度的增加，代谢物的种类会增加，这可能是由于烘焙过程中的热诱导反应造成的。OPLS-DA分析表明，五种乌龙茶之间存在显著差异，R2X=0.728，R2Y=0.963，Q2=0.792（图1c）。HCA支持这些区别（图1d），SX、RG和DD聚集在一起，与GS和TGY不同，与相应的烘焙度一致。
2.1 地区差异
25种乌龙茶按产地可分为三个区域：闽南的TGY、闽北的SX和RG、台湾的GS和DD。所鉴定的非挥发性化合物的PCA（图2a1）和OPLS-DA（图2b1）在乌龙茶的三个地区之间显示出明显区别。主成分分析得分图显示，前两个主成分解释了总方差的61.1%（t[1]=37.6%，t[2]=23.5%，R2X（cum）=0.662，Q2（cun）=0.344）。OPLS-DA模型表现出更明显的聚类，R2X=0.525，R2Y=0.949，Q2=0.886。OPLS-DA模型的可靠性通过置换检验得到证实，R2和Q2的截距分别为0.545和-0.422（图2c1）。根据OPLS-DA结果，共有87种代谢物（VIP>1，p<0.05）被确定为不同地区之间的显著区分物（表1A）。这些鉴别分子包括19种儿茶素及其衍生物、12种茶黄素、21种黄酮类化合物和黄酮苷、6种原花青素和双黄烷醇、6种单宁、6种酚酸及其衍生物、3种有机酸及其衍生物，2种生物碱、5种吡咯烷酮、2种羟基香豆素、3种芳香族化合物、1种二苯乙烯和1种叶绿素。
表1A 负责不同地区代谢组学变化的关键代谢物（VIP>1）
Type，按化合物类型分类。Order，从上到下按顺序排列的物质数量。Observed m/z，实际测量过程中物质的质荷比信息。δ，质量误差。Rt，保留时间。Component name，根据质荷比、碎片信息等从茶叶谱数据库中最有可能匹配的物质。MS/MS Fragments，与茶叶谱数据库匹配的片段。*，根据文献数据和Rt进行鉴定，其他则用片段进行鉴定。/，化合物被鉴定为没有理论片段。
图2 25种乌龙茶的多元分析。（a1）基于区域差异的PCA评分图。（b1）基于区域差异的OPLS-DA评分图。（c1）基于区域差异的OPLS-DA置换图。（d1）基于区域差异的关键代谢物热图分析。（a2）基于烘焙程度差异的PCA评分图。（b2）基于烘焙度差异的OPLS-DA评分图。（c2）基于烘焙程度变化的OPLS-DA置换图。（d2）基于烘焙程度变化的关键代谢物热图分析。每一列代表一个茶叶样本，每一行代表一个关键代谢物。从蓝色到黄色，再到红色的颜色编码等级是指关键代谢物的含量从低到高变化。地块进行了行标准化。
热图直观显示了乌龙茶三个地区（闽南、闽北和台湾）87种关键代谢产物的差异（图2d1）。每一行代表一种代谢物，所有成分分为13组，对应于表1A、表1B，每一行表示一个样本。颜色梯度从绿色到红色，分别表示相对强度从低到高。根据OPLS-DA的结果，我们将25种茶产品视觉上分为三组。SX和RG的代谢物含量分布相似，GS和DD也是如此。在不同地区的乌龙茶中，尤其是在TGY，茶黄素、黄酮、黄酮苷、生物碱和吡咯烷的含量存在显著差异。TGY中的大多数差异代谢物含量明显低于其他茶，而1,6-di-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖（1,6-2O-G-葡萄糖(Glu)）、1-O-没食子酰-β-D葡萄糖（1-O-G-Glu）和2,6- di-O-葡萄糖（2,6-2O-Glu）的水平略高。此外，儿茶素在不同地区的乌龙茶中表现出最小的变异系数，CG、EAG、EC、ECG、EGC、EGC-3′-Me-G和EGCG是TGY中含量最高的代谢物之一。
表1B 关键代谢物（VIP>1）负责不同烘焙程度之间的代谢组学变化
Type，按化合物类型分类。Order，从上到下按顺序排列的物质数量。Observed m/z，实际测量过程中物质的质荷比信息。δ，质量误差。Rt，保留时间。Component name，根据质荷比、碎片信息等从茶叶谱数据库中最有可能匹配的物质。MS/MS Fragments，与茶叶谱数据库匹配的片段。*，根据文献数据和Rt进行鉴定，其他则用片段进行鉴定。/，化合物被鉴定为没有理论片段。
不同乌龙茶产区的游离氨基酸（包括茶黄素）存在显著差异。以往对福建、广东和台湾乌龙茶化学成分差异的研究发现，茶氨酸和游离氨基酸含量的变异系数超过50%，而水提取物、茶多酚、总儿茶素和CAF的变异系数低于50%。我们比较了8个国家17个地区乌龙茶中儿茶素和游离氨基酸的变化，突出了不同地区乌龙茶游离氨基酸含量的显著差异，儿茶素（ECG、C、EGC和EGCG）的变异系数接近或超过50%。本研究也得到了类似的结果。品种和加工技术可能是乌龙茶中关键差异代谢物鉴定不一致的原因。
2.2 烘焙程度差异
25种精选的乌龙茶根据烘焙程度分为三个等级：UF（无火烘焙茶）、MF（中火烘焙茶）和UF（大火烘焙茶）。如图所示，检测到的非挥发性化合物的PCA（图2a2）和OPLS-DA（图2b2）对乌龙茶的三种烘焙程度进行了区分。PCA评分图显示，前两个PC解释了总变异的61.1%（t[1]=37.6%，t[2]=23.5%，R2X=0.662，Q2=0.344）。OPLS-DA显示出更明显的聚类，R2X=0.487，R2Y=0.891，Q2=0.762。置换测试验证了OPLS-DA模型的可靠性（图2c2），R2和Q2的截距分别为0.514和-0.400。对这些茶的分析虽然不是来自同一批新鲜茶叶，但已被证明可以提供统计数据所反映的有价值的见解。通过应用多元统计技术来评估根据烘焙程度区分的乌龙茶，可以有效地将它们分为三个明确的组。这一发现证明了多元统计分析在基于烘焙程度对乌龙茶进行精确区分方面的实用性，并表明经过不同烘焙过程的茶的代谢物组成存在显著差异。因此，我们使用OPLS-DA，确定了一组与烘焙程度相关的77种关键差异代谢物（VIP>1，p<0.05），如表1B所示。已鉴定的化合物分为13个不同的类别，其中包括22种儿茶素及其衍生物、4种茶黄素、19种黄酮类化合物和黄酮苷、4种原花青素和双黄烷醇、2种单宁、4种酚酸及其衍生物、6种有机酸及其衍生物、1种生物碱、5种吡咯烷酮、1种羟基香豆素、7种芳香族化合物、1种二苯乙烯和1种嘧啶核苷。
热图显示了乌龙茶不同烘焙程度之间77种关键代谢物的差异（图2d2）。尽管不同烘焙程度的乌龙茶中关键差异代谢物的类别与不同产地的乌龙茶相似，但每种类别的贡献和所涉及的特定代谢物存在很大差异。随着烘焙程度的增加，不同代谢物的浓度也有相应的上升趋势。与未烘焙的茶（UF）相比，烘焙茶（LF、HF）不仅表现出儿茶素衍生物、黄酮类化合物和黄酮苷代谢物的种类和数量增加，而且除了EC和EGC等一些单体儿茶素外，被称为黄酮生物碱的特定儿茶素衍生物也显著增加。这些化合物包括5′'-R-ethylpyrrolidinonyl EGC、5′'-R--ethylpyrrolidinonyl EGC-3-O-没食子酸酯、5′'-R-ethylpyrrolidinonyl GC、5′′'-S-ethylpyrrolidinonyl EGC、5-′'-S-ethylpyrrolidinonyl EGC-3-O-没食子酸酯和5′'-S-ethylpyrrolidinonyl GC。我们之前的报告还表明，SX和RG含有更丰富的儿茶素衍生物，这些物质在RG中的含量比SX高59.0%至92.9%。此外，RG中仅鉴定出5′'-R-ethylpyrrolidinonyl EC-3-O-没食子酸酯等化合物。黄酮类化合物，包括黄酮醇苷和黄酮苷，被认为是茶中除儿茶素外最重要的酚类化合物。黄酮醇苷，特别是杨梅素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-α-D-半乳糖苷，是给茶汤的味道带来干燥感并增加CAF苦味的关键物质。尽管其含量低于儿茶素，但它们可以在低含量下为茶带来天鹅绒般的柔软和明显的干燥，这对茶的整体质量至关重要。
本研究鉴定了19种黄酮类化合物和黄酮苷类化合物，其中5种黄烷醇-O-糖苷（山奈酚-7-半乳糖(Gal)-3-芸香糖苷(Rut)、杨梅素-3-O-β-D-Glu、槲皮素3-O-Gal-Rut、槲皮素3-O-Glu-Rut、槲皮素3-O-β-D-Glu）和1种黄酮-C糖苷（牡荆素-2′'-α-L-Rha）对烘焙样品的分类有显著贡献。先前的研究表明，随着SX和RG烘焙程度的增加，黄酮苷的含量降低了25%以上，这与其他报道初步一致。相反，N-乙基-2-pyrrolidinone取代的黄烷-3-醇（EPSFs）的浓度增加。在这项研究中，我们发现LF和HF中的黄酮苷含量明显高于UF。然而，在烘焙过程中，我们检测到8种EPSF（puerins I-VIII），它们的丰度与烘焙程度呈正相关，推测黄酮苷含量的观察结果与其在新鲜茶叶中的原始水平有关。我们在茶叶中发现了几种EPSF，它们的存在已被证实与儿茶素和表儿茶素含量的减少有关。在烘焙温度下，EPSF的浓度迅速上升，这表明它们可能是烘焙过程中形成的化合物。氨基酸茶氨酸最初经历Strecker降解和环化形成1-乙基-5-羟基-2-吡咯烷酮，然后与儿茶素共价结合形成N-乙基-2-吡咯烷酮取代的EPSF。与EGCG相比，EPSF具有更高的苦味和涩味阈值，这在一定程度上解释了苦味和涩感的降低。为了进一步分析烘焙程度对儿茶素变化的影响，我们随后的研究从SX和RG中选择了一种具有代表性的生茶，以追踪不同烘焙程度下儿茶素和CAF的变化。
3. 游离酸概况
我们使用自动氨基酸分析仪对氨基酸及其衍生物进行定量和分析（表S4），其中每种茶类型代表五种选定代表性茶样品的平均含量。在25个乌龙茶样本中，我们共鉴定并定量了23种游离氨基酸，其中Pro仅在DD中检测到，而其他22种氨基酸存在于所有乌龙茶中。就总含量而言，乌龙茶从高到低依次为：DD>TGY>SX>GS>RG，平均含量分别为1392.46±593.47µg/g、509.42±61.88µg/g、386.23±82.52µg/g、321.60±126.41µg/g和122.44±92.11µg/g。烘焙对乌龙茶的氨基酸含量有显著影响，随着烘焙程度的增加呈下降趋势。RG中的总氨基酸含量最低，约为SX的30%。TGY、SX和RG均产自福建，烘焙程度与总氨基酸含量呈显著负相关。烘焙是乌龙茶生产中的关键工序，对其口感特征的发展至关重要。在烘焙过程中，丰富的氨基酸和还原糖之间的美拉德反应增强了乌龙茶独特风味的形成。茶氨酸、谷氨酸和天冬氨酸以高浓度存在，含量最高，从26.32%到59.35%不等，在赋予茶饮鲜味和减轻苦味和涩味方面发挥着重要作用。众所周知，Thea有助于茶冲泡的鲜味，并抵消涩味和苦味，但在烘焙过程中其含量会急剧下降。例如，RG中的茶氨酸含量为32.23µg/g（26.32%），仅为TGY中茶氨酸的11.4%。这种减少可能是由于茶氨酸和葡萄糖在高温烘焙下发生美拉德反应，导致乌龙茶中杂环化合物的形成。这种减少，再加上儿茶素含量的降低，可能有助于EPSF的出现。Wang等人报告称，鲜味强度的趋势与氨基酸及其衍生物的趋势相匹配，这表明这些化合物可能是茶冲泡中鲜味分化的主要因素。
4. 关键差异代谢物与味觉属性的校正分析
如图3a所示，我们对来自不同产地的乌龙茶的关键差异代谢物和味道属性进行了相关性分析。由于差异代谢物的丰富，相关性分析的结果相当复杂。因此，我们选择了排名前20的差异代谢物，并将其与得分较高的味道属性相关联（图3b）。研究结果表明，苦味与所有20种化合物呈正相关，与槲皮素-3-ara和QA呈显著正相关（p<0.05）。相比之下，甜味回味与所有20种成分均呈负相关，与assamicain C、5-没食子酰奎宁酸、theogallin和QA呈显著负相关（p＜0.01），与槲皮素-3-ara、杨梅素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-Gal-Rut和theasinensin呈显著负相关性（p＜0.05）。稠和涩分别与theacitrin A、dehydrotheasinensin H、prodephinidin A 2,3′-G、prodephinidin B和theacitrinin B呈高度显著的正相关（p<0.01）。鲜味在摄入后会产生食欲的初始增加，并表明营养含量，这主要是由水产品中的鲜味肽引起的。然而，在茶中，鲜味与这些物质中的每一种都呈显著负相关（p＜0.05），与EC-（4β→8）-EGCG、EGC-（4β→8）-ECG、GC-（4α→8）-儿茶素-3-O-没食子酸酯呈高度显著正相关（p＞0.01），与异夏佛塔苷呈显著正相关。
图3 味觉属性与植物化学成分之间的相关性。（a1）87个地区差异化合物与味觉属性之间的相关性。（b1）前20个地区差异化合物与关键风味属性之间的相关性。（a1）77种烘焙差异化合物与味道属性之间的相关性。（b2）前20种烘焙差异化合物与关键风味属性之间的相关性。
随后，我们对乌龙茶在不同烘焙程度和口感属性下的所有关键差异代谢物进行了相关性分析，结果如图3c所示。图3d展示了排名前20位的差异代谢物与得分较高的味觉属性之间的相关性分析。除了5-没食子酰奎宁酸和theogallin外，不同烘焙程度的乌龙茶的前20种差异代谢物与不同地区的乌龙茶前20种不同代谢物表现出完全不同的特征。结果表明，甜味、鲜味和稠度与不同化合物之间存在很强的相关性。具体而言，除theogallinA、prodelphinidin B-4、异茶黄素和原花青素B2外，甜味回味与其他16种差异代谢物显著相关，特别是与肉桂酸、icariside B5、1-O-G-β-D-Glu、次黄嘌呤和乳酸呈极显著正相关，与5′'-R（S）-ethylpyrrolidinonyl catechin、5′'-S-ethylpyrrolidinonyl EC、puerin I-II、儿茶素、5-没食子酰奎宁酸、theogallin和assamicain C呈极显著负相关。鲜味与差异化合物之间的相关性与由不同的化合物组成。例如，鲜味与prodelphinidin B-4和异茶黄素呈正相关，与phoglucinol、5′'-R（S）- ethylpyrrolidinonyl catechin、5′'-S- ethylpyrrolidinonyl EC和puerin I-II呈负相关，而稠味则呈相反关系。苦味与儿茶素和槲皮素-3-O-β-D-Glu呈显著正相关。这些发现与之前的报告一致。
5. 烘焙对SX和RG风味和主要化合物组成的影响
我们使用高效液相色谱法分析了25种选定的商业茶（表S5（a））以及不同烘焙度的SX和RG茶中儿茶素和CAF的含量分布，包括EGC、C、EC、EGCG、CAF和ECG，分别如图4所示。如图4（a）所示，TGY和DD的总含量远低于其他三种乌龙茶。SX和RG中六种化合物的含量分布非常相似，EGC、C、EC和EGCG的含量低于其他三种乌龙茶（TGY、GS和DD），而CAF的含量相对较高。这可能是由于WRT的烘焙程度较高，导致与其他三种茶相比，非酯化儿茶素增加，表型儿茶素减少。
图4 儿茶素和CAF含量的变化。（a）25种乌龙茶的含量分布。（b）根据25种乌龙茶的烘焙程度分类的含量分布。（c）不同烘焙程度的水仙和肉桂茶中的含量分布。返回搜狐，查看更多
责任编辑：